酵母雙雜交文庫篩選服務

我們擁有多年的文庫構建和篩選經驗,已完成數千個各類文庫,訂單來自海內外,可以有效保證文庫的覆蓋度和文庫篩選目的基因的檢出。

  • 產品詳情

酵母雙雜交文庫篩?。?/span>
 
一、核蛋白酵母雙雜交文庫篩選技術服務(可以選擇使用invitrogenpDEST22clonetechpGADT7兩套系統進行篩選,可以使用預制商業化文庫或者本公司定制構建的酵母雜交文庫)

1.實驗原理

    蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎,研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的實驗。很早就已知道,轉錄活化蛋白可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄反應。這種DNA 結合與轉錄激活的功能是由轉錄活化蛋白上兩個相互獨立的結構域即DNA 結合結構域(BindingDomain, BD)和轉錄活化結構域(Activation Domain,AD)分別來完成的,并且這兩個結構域對于基因的轉錄活化都是必須的。目前酵母雙雜交實驗采用的系統有LexA系統和Gal4系統兩種。在LexA系統中,DNA結合結構域由一個完整的原核蛋白LexA構成,轉錄活化結構域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42構成,它在酵母中可以活化基因的轉錄; 在Gal4系統中,BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結構域(1-147aa與768-881aa)構成。在利用GAL4系統篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時,DNA結合結構域與靶蛋白即"誘餌"相結合,轉錄活化結構域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結合。一般情況下,單獨的BD可以與GAL4上游活化序列(GALUAS)結合但不能引起轉錄,單獨的AD則不能與GALUAS結合,只有當BD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導致兩者在空間上相互靠近時,BD與AD才能與GALUAS結合并且引起報道基因的轉錄。在BD與AD要導入的酵母菌AH109中,通過基因工程的方法在GAL4 UASs和啟動子的下游構建了3個報道基因--ADE2,HIS3,MEL1(或LacZ),因此可以通過營養缺陷篩選和酵母菌表型的改變來篩選或驗證兩個蛋白之間是否存在相互作用。GAL4系統的原理如圖所示


                                  

酵母雙雜交系統工作原理

2.系統特點

   同以往研究蛋白質-蛋白質之間相互作用的實驗手段相比,雙雜交系統具有其獨特優勢。首先,融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內進行,蛋白質有可能保持天然的折疊狀態,類似其在體內生理狀態下的情況,這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的,因此較之后者,它所證實的蛋白質間相互作用將更接近于在體的真實水平。其次,雙雜交系統的敏感度即高,可以檢測到在蛋白質之間結合常數低至1mmol/L 左右的微弱作用。許多微弱或短暫的蛋白質之間的相互作用可以借助報道基因表達過程中的多級放大效應反映出來;融合蛋白基因在強啟動子的作用下,處于較高的表達水平。第三,在篩選cDNA 文庫時,雙雜交系統能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列,它只需構建質粒而不必準備抗體或純化蛋白,省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。 
    需要指出的是,融合體蛋白必須轉運至核內才能活化轉錄,因此對于胞外配體-受體作用以及需要核外修飾或受磷酸化等翻譯后修飾過程介導的蛋白質間相互作用而言,該系統的應用受到一些限制。在進行文庫篩選時,假陽性結果常常干擾實驗的準確性,除某些文庫編碼的蛋白質本身含有轉錄活化成分外,細胞內的其它無關蛋白也可能有類似作用,因此雙雜交系統檢測的結果必須通過其它蛋白間相互作用的實驗來進一步驗證。

3. 我們的工作內容

    您只需提供用于篩選的誘餌質粒信息,我們會完成整個的篩選工作,主要包括以下內容:
3.1 誘餌載體的構建
3.2 誘餌質粒的自激活檢測
3.3 文庫質粒和誘餌質粒共轉酵母感受態細胞
3.4 文庫篩選和3AT優化
3.5 文庫篩選結果測序分析
3.6 篩選結果回轉驗證
3.7 詳細報告的整理和數據發送

4.交付結果

提供詳細的、完整的實驗報告,清晰的實驗圖片,篩選結果的測序結果,質粒等。

5.服務報價

3 萬元整,現9折促銷,即:2.7萬元。

6.服務周期

80個工作日


二、膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選技術服務(使用DUALmembrane 技術系統)

1. DUALmembrane 技術原理

    DUALmembrane 技術在傳統的酵母雙雜交系統的基礎上,巧妙地利用分離的泛 素系統(split-ubiquitin)進行跨膜蛋白相互作用的篩選。

    分離的泛素系統(split-ubiquitin) 泛素可以人為分成兩部分:N 端(Nub),C 端(Cub)。

  

    正常情況下,Nub 和 Cub 仍具 有很高的親合力,表現出野生型 泛素的功能,即仍發揮降解蛋白 質的信號功能。

   那么如何將泛素系統和酵母雙雜交融合成一體呢?

   首先,人為地將泛素 Nub 的 3 位異亮氨酸突變為甘氨酸(NubI 突變為 NubG)。 這樣與 Cub 的親合力大大降低,避免了 Cub 和 Nub 自我結合或接近的可能性;。

   其次,將 Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常條件下 NubG 不與 Cub 結合,UBPs 也不能識別分離的泛素,轉錄激 活因子也不會被切下來。最后,將要檢測的蛋白質分別與 NubG 和 Cub 融合,形成 bait 融合蛋白(bait-cub-LexA-VP16)和 prey 融合蛋白(prey-NubG)。如果 bait 和 prey 發 生相互作用,就會促使 NubG 和 Cub 的相互接近,從而得到重構,被 UBPs 識 別,導致 LexA-VP16 的解離,進入核內,從而激活報告基因的轉錄。

2.系統特點

  可以篩選跨膜蛋白間的相互作用,消除酵母雙雜交系統的一些缺陷。

3. 我們的工作內容

   您只需提供用于篩選的誘餌質粒信息,我們會完成整個的篩選工作,主要包括以下內容:
3.1 誘餌載體的構建
3.2 誘餌質粒的自激活檢測
3.3 文庫質粒和誘餌質粒共轉酵母感受態細胞
3.4 文庫篩選和3AT優化
3.5 文庫篩選結果測序分析
3.6 篩選結果回轉驗證
3.7 詳細報告的整理和數據發送

4.交付結果

提供詳細的、完整的實驗報告,清晰的實驗圖片,篩選結果的測序結果,質粒等。

5.服務報價

3 萬元整

6.服務周期

80個工作日

7.客戶文章

核蛋白酵母雙雜交文庫客戶文章示例:

【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],ata in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha, M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


酵母單雜交文庫客戶文章示例:

【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

膜蛋白雙雜交文庫客戶文章示例:

【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

 中文論文:

【1】張云云,周 君, 李 曄. 可口革囊星蟲(Phascolosoma esculenta)酵母雙雜交文庫和鐵結合蛋白真核表達載體的構建. 海洋與湖沼,44卷,第6期。

【2】歐陽沫, 唐瀟,黃惜,袁紅梅。巴西橡膠樹HbICE1 基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及互作蛋白的篩選。植物科學學報,2016,34(2): 255~262.

【3】岳珊珊,夏來新。酵母雙雜交篩選與果蠅C(2)M相互作用的蛋白。遺傳,2015.11,37(11)

【4】專利:一種結合串聯重復序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質



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